Kultivácia buniek - popis metódy

Bunkové (tkanivové alebo pletivové) kultúry v súčasnosti predstavujú jedny z najpoužívanejších biologických modelov, ktoré sa využívajú vo výskume ale aj v praktických aplikáciách. Ide o kultiváciu buniek (živočíšnych aj rastlinných) in vitro v laboratóriu. Bunkové kultúry sa začali využívať začiatkom 20. storočia prácami Gottleiba Haberlandta (rastliny) a Alexisa Carrela (živočíchy) a následne sa v rôznych formách stali dôležitou súčasťou biologických, biochemických a biomedicínskych experimentov. 

V porovnaní s inými experimentálnymi objektmi majú bunkové kultúry množstvo výhod. Väčšinou sú veľmi dobre definované, umožňujú prácu len s jediným typom buniek, je možné jednoduchšie ovplyvniť funkcie cieľových buniek a tiež sa jednoduchšie kontroluje odpoveď buniek na externé vplyvy (napr. toxíny, liečivá a pod.). Bunkové kultúry produkujú klony, v ktorých majú všetky bunky rovnaký genotyp. Pri niektorých aplikáciách je využitie bunkových kultúr výhodnejšie v porovnaní s in vivo (na celom organizme) metódami, pri ktorých je ťažké získať detailné informácie napr. o jednotlivých štádiách bunkových procesov, prípadne dochádza k interakcii sledovaných procesov s inými fyziologickými procesmi v organizme. Výhodou je aj možnosť dlhodobého uskladnenia živých buniek kultúry v tekutom dusíku. Poškodeniu buniek počas zmrazovania sa zabraňuje pridaním kryokonzervačných látok a vhodným postupom (a rýchlosťou) zmrazovania a rozmrazovania. Pri využití živočíšnych bunkových kultúr oproti in vivo pokusom s celým živočíchom navyše odpadá problém s etikou experimentu (usmrcovanie, bolesť). Na druhej strane má aplikácia bunkových kultúr aj mnohé obmedzenia. Neumožňujú sledovať procesy v organizme, keď sú aktívne všetky regulačné mechanizmy. Bunky sú v kultúre kultivované pri nefyziologických podmienkach, bez vplyvu okolia, typického pre daný typ buniek v organizme. Bunky niekedy počas kultivácie dediferencujú, alebo zmenia fenotyp. Hlavný problém predstavuje interpretácia výsledkov, resp. neistota, nakoľko je preparát tkaniva, kultivovaný v odlišných podmienkach, rovnaký ako tkanivo v organizme. Napr. pri kultivácii buniek živočíšneho tkaniva v médiu budú mať bunky k dispozícii oveľa viac výživy a médium bude odvádzať viac produktov metabolizmu, ako v prostredí in vivo pri normálnom krvnom zásobení. V dôsledku toho bunky strácajú kontrolu nad procesmi, ktoré sa normálne vykonávajú autoregulačne prostredníctvom krvného obehu. Využitie bunkových kultúr má tak oproti in vivo technikám výhody aj nevýhody. Závisí od konkrétnej aplikácie, ktoré techniky bude vhodnejšie zvoliť a dosiahnuť tak optimálny výsledok experimentu. 

Bunkové kultúry potrebujú definovaný prísun energie a zdrojov pre ich metabolizmus. Práca s bunkovými kultúrami vyžaduje dobre vybavené laboratórium, vyškolených pracovníkov, finančne náročné chemikálie a jednorázový sterilný spotrebný materiál. Nevyhnutným predpokladom pre úspešnú prácu s bunkovými kultúrami je sterilita prostredia, zabránenie kontamináciám a vytvorenie podmienok podobných stavu in vivo. K základnému vybaveniu laboratória možno preto zaradiť sterilný laminárny box a inkubátor s riadenou atmosférou (vyšší parciálny tlak CO₂, vysoká relatívna vlhkosť), centrifúga, autokláv a hlbokomraziaci box. Laboratórium sa musí udržiavať vždy (aj keď sa nerealizujú žiadne experimenty) čisté, bezprašné, izolované od ostatnej plochy budovy a musí byť ľahko dezinfikovateľné. Na sledovanie buniek sa využíva mikroskop vybavený fázovým kontrastom.

Bunková kultúra sa zakladá izoláciou určitého typu živočíšnych alebo ľudských buniek. Ide o tzv. primárnu kultúru. Na izoláciu sa využívajú rôzne techniky, založené na mechanickom a enzymatickom rozrušení tkaniva, alebo zberu buniek z telových tekutín a pod. Kultivácia buniek prebieha v kultivačnom médiu v špecifických teplotných a vlhkostných podmienkach. Bunky sa kultivujú buď v suspenzii ako jednotlivé bunky či malé skupiny buniek, alebo v médiu najčastejšie adherované na vhodnom povrchu alebo v suspenzii. Na identifikáciu izolovaných buniek sa spravidla používajú imunocytochemické techniky alebo molekulárno-biologické metódy. Kultivačné podmienky by mali čo najpresnejšie napodobniť fyziologické podmienky in vivo, ktoré zabezpečujú kultivačné médiá a technické vybavenie laboratória (inkubátory). Kultivačné médiá pozostávajú zo zmesi niekoľkých desiatok látok. Spravidla obsahujú vyvážený pomer aminokyselín, cukrov (zdroj energie), vitamínov, solí, lipidov (mastné kyseliny, glyceridy a pod.), stopových prvkov, kofaktorov a stabilizátorov pH a osmotického tlaku (anorganické soli). Dôležitú funkciu v médiu majú rastové faktory. Ako zdroj rastových faktorov, rastových inhibítorov, albumínov a ďalších látok, dôležitých pre rast kultúry, sa používa krvné sérum, najčastejšie hovädzie fetálne sérum (FBS). Istou nevýhodou médií so sérom je, že nie je presne definovaná koncentrácia všetkých látok, takže rastové charakteristiky sa môžu líšiť podľa šarže použitého séra. Na druhej strane kultivácia buniek v definovanom médiu bez séra býva náročnejšia, kultivačné médium je nutné doplniť rastovými faktormi a ďalšími látkami. Tlmivá zložka média udržiava stále pH, ktoré je z hľadiska podmienok kultivácie veľmi dôležité. Na uľahčenie práce s bunkovou kultúrou sa do média môže pridať acidobázický indikátor, ktorý v prípade zmeny pH mení zafarbenie média. Nevyhnutným predpokladom využitia média je tiež jeho sterilita a stabilita jeho zložiek. Vážnym problémom pri kultivácii buniek je mikrobiálna kontaminácia. Pre elimináciu tohto javu sa do kultivačného média môže pridať zmes antibiotík/antimykotík (1 %). Bunky sa kultivujú pri telesnej teplote (37°C) v kultivačných nádobách a v atmosfére so zvýšenou koncentráciou (5 – 10 %) CO₂. Pokiaľ sa bunky kultivujú ako adherentná kultúra, dôležité sú aj vlastnosti povrchu kultivačnej nádoby. Väčšina typov buniek vyžaduje hydrofóbny povrch, najčastejšie sa na tento účel využíva špeciálne ošetrený polystyrén. Po namnožení sa adherentné bunky uvoľnia z kultivačného povrchu (napr. odstránením dvojmocných iónov, pomocou proteáz, mechanicky alebo zmenou teploty) a nariedená suspenzia buniek sa prepipetuje do novej kultivačnej nádoby – ide o tzv. pasážovanie buniek. Počet buniek sa počas kultivácie vo väčšine prípadov zvyšuje exponenciálne až do okamihu, kedy sa bunky začnú tesne dotýkať. Stav bunkovej kultúry v určitom čase je možné posúdiť ich počítaním (svetelný mikroskop, hemocytometer alebo elektronický systém). Výsledok môže byť vyjadrený ako počet buniek na 1 mililiter média (pre suspenzné kultúry) alebo v centimetroch štvorcových pokrytého povrchu (pri adherentných monovrstvových kultúrach). V dôsledku kontaktnej inhibície sa potom rast a delenie buniek spomaľujú až zastavia. Väčšina adherentných kultúr nakoniec vytvorí na povrchu kultivačnej nádoby splývajúcu vrstvu s hrúbkou jednej bunky (monovrstva, monolayer). Kultivované bunky majú zväčša obmedzenú životnosť, po niekoľkých pasážovaniach starnú a ich ďalšie delenie sa postupne zastaví. Niektoré typy buniek (niektoré transformované alebo nádorové) je možné kultivovať kontinuálne. Okrem prípravy vlastných primárnych kultúr si výskumné laboratóriá môžu bunkové kultúry zakúpiť prostredníctvom biotechnologických firiem.