Real-time PCR - popis metódy
Real-time polymerázová reťazová reakcia (real-time PCR) sa využíva na stanovenie množstva nukleovej kyseliny. Metóda umožňuje stanoviť počiatočné množstvá templátu na základe priebežného sledovania prírastku produktu po každom PCR cykle - teda v „reálnom čase“ tvorby produktu.
Kontinuálne meranie pribúdajúceho PCR produktu je založené na
jeho fluorescenčnom označení v priebehu reakcie a uskutočňuje sa v
špeciálnych real-time PCR termocykleroch.
Na fluorescenčné označenie PCR produktu sa používajú:
A) fluorescenčné farbivá, ktoré sa špecificky viažu na dsDNA
B)
fluorescenčne označené hybridizačné sondy
C) fluorescenčne označené primery
V praxi sa najčastejšie využívajú prvé dva spôsoby.
Značenie PCR produktu fluorescenčnými farbivami
Princípom tejto metódy je naviazanie fluorescenčného farbiva
do dvojvláknovej DNA počas
PCR reakcie. V súčasnosti sa najčastejšie
používajú farbivá typu SYBR Green I a jeho modifikácií (napr.
SYBR Green ER). Tieto farbivá majú veľmi nízku fluorescenciu v
nenaviazanom stave, ktorá sa po väzbe na dsDNA zvyšuje až 1000x.
Fluorescenčný signál sa zaznamenáva najčastejšie na konci
polymerizačného kroku každého cyklu PCR (po skončení elongácie), alebo
kontinuálne. V detekčnom systéme so SYBR Green I emituje fluorescenčný
signál každá dsDNA molekula. Preto je tento systém vysoko univerzálny,
jednoduchý, a je ho možné použiť s ľubovoľnými primermi. Jeho
nevýhodou však je, že zaznamenávaný signál obsahuje aj fluorescenciu z
nešpecifických produktov PCR reakcie a z primer-dimérov. Pred
vyhodnotením výsledkov z PCR je preto potrebné overiť neprítomnosť
nešpecifických PCR produktov v ukončenej reakcii analýzou
krivky topenia.
Fluorescenčne značené hybridizačné sondy
Táto metóda je založená na hybridizácii špecifického, fluorescenčne
označeného oligonukleotidu s PCR produktom. Fluorescenčný signál sa v
tomto prípade generuje trochu zložitejšie. Využíva sa spektroskopický
proces prenosu energie medzi dvomi
fluoroformi alebo medzi fluoroforom a zhášačom, označovaný ako FRET
(fluorescence resonance energy transfer). Tento proces prebieha iba
vtedy, ak sú oba fluorofory (alebo fluorofor a zhášač) v blízkej
vzdialenosti a majú prekrývajúce sa absorbčné a emisné spektrá.
Príkladom detekčného systému na princípe
FRET sú hybridizačné sondy TaqMan. Sú to oligonukleotidy komplementárne
s vnútornou sekvenciou sledovaného PCR produktu. Na 5´ konci
obsahujú naviazané reportérové florescenčné farbivo (napr. FAM, VIC,
NED, TET) a na 3´ konci sa nachádza zhášač. Zhášač môže byť
fluorescenčný, napr. TAMRA, alebo nefluorescenčný (DABCYL, Black Hole
Quencher a pod.). V nehybridizovanom oligonukleotide je malá
vzdialenosť medzi fluorescenčným farbivom a zhášačom, ktorá blokuje
flourescenciu v dôsledku FRET. Po hybridizácii sondy s vláknami
pribúdajúceho PCR produktu sa v elongačnom kroku pôsobením 5´
exonukleázovej aktivity Taq polymerázy sonda od 5´konca hydrolyzuje,
čím sa fluorescenčné farbivo vzdiali od zhášača a začne emitovať
fluorescenciu. Fluorescencia sa v každom cykle zvyšuje úmerne
s pribúdajúcim PCR produktom.
Na nasledujúcom obrázku sú znázornené krivky závislosti fluorescencie od počtu cyklov v real-time PCR.
Samotné stanovenie počiatočného množstva (koncentrácie)
molekúl sa realizuje analýzou uvedených kriviek. Prvé významné zvýšenie
množstva PCR cez tzv. prah detekcie (threshold) koreluje s množstvom
templátu
DNA a vyjadruje sa počtom cyklov pri prekročení prahu detekcie Ct.
Kvantifikácia v real-time PCR môže byť:
- absolútna – zisťuje sa presný
počet molekúl DNA, RNA pred amplifikáciou; napr. množstvo baktérií,
vírusov, CNVs...; pre porovnanie vyžaduje štandard so známou
koncentráciou
- relatívna – porovnáva množstvo DNA, RNA medzi vzorkami; napr.
expresiu
génov v rôznych tkanivách; pre porovnanie vyžaduje referenčný gén so
stálou expresiou (tzv. referenčné - housekeeping-ové gény,
napr. Glyceraldehyd-3-fosfát
dehydrogenáza, Beta-aktin, RPLP0...)