Izolácia RNA - popis metódy
V eukaryotickej bunke sa nachádza niekoľko typov RNA s rôznou
funkciou a s rôznymi veľkosťami. Okrem hnRNA a mRNA, ktoré môžu mať
dĺžku 10-15 kb sa v bunkách nachádza veľké množstvo ribozomálnych RNA
(28S, 18S a 5S) a tRNA s veľkosťou od 0,1 kb až do 5 kb. Experimenty s
RNA umožňujú sledovať a porovnávať expresiu génov (Northern blotting,
RT-PCR, real-time PCR, expresné microarrays), klonovať gény (cDNA)
alebo regulovať expresiu génov (antisense RNA, RNA interferencia). V
uvedených typoch experimentov sa najčastejšie využíva mRNA, buď
purifikovaná, zbavená ostatných typov RNA, alebo v zmesi tzv. celkovej
RNA bunky.
Pri práci s RNA je veľmi dôležité blokovať aktivitu RNA
degradačných enzýmov, ribonukleáz (RNáz). Inhibíciu aktivity
endogénnych RNáz zvyčajne zabezpečuje okamžité spracovanie vzorky
biologického materiálu po odbere v lyzačnom roztoku s inhibičným
účinkom na RNázy (guanidín izotiokyanát, fenol) alebo v prípade odberu
vzorky v teréne, jej okamžité zmrazenie v tekutom dusíku alebo uloženie
do špeciálnych skladovacích roztokov, napr. RNAlater. Rovnako dôležité
je však zabránenie kontaminácie spracovávanej vzorky RNázami z
roztokov, laboratórneho skla, plastov, ako aj z potu rúk
experimentátora. Preto je nevyhnutné pri práci s RNA vždy používať
ochranné latexové rukavice a laboratórne pomôcky zbavené RNáz.
Kompletná inhibícia aktivity RNáz je pomerne náročná, pretože RNázy sú
mimoriadne termostabilné enzýmy (zachovávajú si aktivitu aj po
autoklávovaní pri 121°C), sú aktívne v širokom rozsahu pH a nevyžadujú
k svojej aktivite prítomnosť kofaktorov. Práca s RNA teda vyžaduje
dôkladnú prípravu roztokov a iného laboratórneho vybavenia, ako sú
skúmavky, pipety a pod. Najvhodnejšie je používať plastový materiál
určený na túto prácu, tzv. RNase-free, prípadne opláchnuť všetky
pomôcky po autoklávovaní chloroformom. Aj napriek použitiu komerčných
súprav a lyzačných roztokov na izoláciu RNA (RNAeasy, Trizol, RNAzol a
pod.) sa nevyhneme príprave niektorých roztokov v laboratóriu. V takom
prípade používame na ich prípravu vždy iba deionizovanú alebo
destilovanú vodu opracovanú s DEPC (dietyl pyrokarbonát) a
autoklávovanú. Pri následnej manipulácií s RNA v enzýmových reakciách
sa ako účinný inhibítor RNáz používa rekombinantný alebo natívny
proteín RNase inhibitor. Pri izolácií RNA sa na lýzu buniek a
denaturáciu proteínov používajú viaceré kombinácie detergentov (SDS) a
fenolu, fenolu s chloroformom, alebo chaotropných zlúčenín guanidín
tiokyanátu a fenolu, ktoré účinne lyzujú bunky alebo tkanivá a zároveň
inhibujú RNázy. Komerčný preparát TRIZOL (Invitrogen, USA) je založený
práve na kombinácií fenolu a guanidín tiokyanátu. Po rozrušení tkaniva
sa pridaním chloroformu vytvoria dve fázy, vodná a organická a RNA sa z
organickej fázy vyzráža izopropanolom.
Podobne ako v prípade izolácie DNA, v súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie RNA z rôznych zdrojov. Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy chemikálií (tzv. kity) určené pre izoláciu RNA z konkrétneho zdroja s vysokou účinnosťou.