Polymerázová reťazová reakcia (PCR) - popis metódy
Polymerázová reťazová reakcia (Polymerase Chain Reaction,
PCR) sa využíva na amplifikáciu - namnoženie špecifických úsekov DNA.
PCR v podstate napodobňuje replikáciu DNA v podmienkach in vitro s tým
rozdielom, že v PCR sa nereplikuje celá DNA ale len jej úsek. PCR
obsahuje nasledovné zložky:
• Taq DNA polymerázu - termostabilný enzým syntetizujúci nové vlákno
DNA,
• Mg2+ - aktivujú DNA polymerázu,
• primery - syntetické jednovláknové oligonukleotidy s dĺžkou 17 - 30
báz. Svojou polohou po hybridizácii vymedzujú požadovaný úsek na
molekule DNA, ktorý chceme amplifikovať. Prvý primer sa viaže na jedno
vlákno DNA, druhý sa viaže na druhé komplementárne vlákno denaturovanej
DNA.
• dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) – stavebné zložky syntetizovaného
vlákna DNA,
• templátovú DNA
Amplifikácia DNA v PCR je cyklický proces, ktorý pozostáva z 3 krokov:
• denaturácie dvojvláknovej chromozomálnej DNA pri 94 °C,
• hybridizácie (annealingu) primerov pri teplote špecifickej pre každý
pár primerov,
• polymerizácie - syntézy nových vlákien DNA pri 72 °C.
Reakcia zvyčajne obsahuje 30 - 40 cyklov, v priebehu ktorých sa
jednotlivé kroky opakujú, pričom pôvodný templát a podľa neho
nasyntetizované kópie slúžia ako predlohy pre vznik ďalších produktov.
V každom cykle (t.j. v troch vyššie uvedených krokoch) sa teda počet
molekúl DNA zdvojnásobí. Po 30 - 40 cykloch je možné dosiahnuť
namnoženie 105- 106 kópií
a teda z pôvodných napr. niekoľko desiatok či stoviek molekúl DNA je
možné získať rádovo nanogramy cieľovej sekvencie, čo je dostatočné
množstvo pre detekciu (elektroforeticky), prípadne pre ďalšie
spracovanie. Teplotný režim sa pred PCR naprogramuje do automatických
programovateľných prístrojov – termocyklerov, ktoré zabezpečujú
striedanie teplôt v krátkych časových úsekoch.