Kultivácia buniek - Manuály

Subkultivácia adherentných bunkových línií

Anotácia: Adherentné bunkové kultúry rastú v podmienkach in vitro, pokým nepokryjú dostupnú plochu alebo nevyčerpajú živiny z média. V tomto bode by sa mali bunkové línie subkultivovať, aby sa zabránilo vymretiu kultúry. Na subklutiváciu buniek je potrebné dostať ich do suspenzie. Stupeň adhézie je pre rôzne bunkové kultúry rôzny, ale vo väčšine prípadov sa na uvoľnenie buniek z kultivačnej nádoby používajú proteázy, napríklad trypsín. Avšak proteázy nemusia byť vhodné pre niektoré bunkové línie, pre ktoré je vystavenie proteázam škodlivé. V týchto prípadoch by sa mali bunky prenášať do suspenzie v malom objeme média mechanicky pomocou bunkovej škrabky.

Materiál a chemikálie: médium ohriate na 37° C, 70 % izopropanol v sterilnej vode, PBS bez Ca²⁺ / Mg²⁺, 0,25 % trypsín/EDTA v HBSS bez Ca²⁺ / Mg²⁺, sójový inhibítor trypsínu, trypánová modrá, bunková kultúra 

Pomôcky a vybavenie: osobné ochranné prostriedky (sterilné rukavice, laboratórny plášť, bezpečnostná clona na oči), vodný kúpeľ nastavený na príslušnú teplotu, laminárny box na príslušnej úrovni ochrany pred kontamináciou, CO₂ inkubátor, označené kultivačné nádoby, centrifúga, mikroskop s inverzným fázovým kontrastom, hemocytometer, popisovač, pipety, stojan na skúmavky

Postup:
1. Pomocou inverzného mikroskopu pozorujeme bunkovú kultúru, posúdime stupeň konfluencie a potvrdíme absenciu bakteriálnej a hubovej kontaminácie.
2. Odstránime staré médium.
3. Premyjeme monovrstvu buniek pomocou PBS bez Ca²⁺ / Mg²⁺ s použitím objemu zodpovedajúcemu polovici objemu kultivačného média. Tento krok opakujeme, ak sú bunky silne adherentné. Niektoré kultúry sú počas rastu adherované na kultivačnú nádobu iba slabo, preto je dôležité zaobchádzať s kultivačnou nádobou opatrne, aby sa zabránilo predčasnému odlepeniu buniek.
4. Napipetujeme roztok trypsín/EDTA na premytú monovrstvu buniek. Použijeme 1 ml roztoku na 25 cm² povrchu kultivačnej nádoby. Premiešame nádobu, aby sme pokryli monovrstvu trypsínom, prebytok zlejeme. Hoci sa väčšina buniek odlepí v prítomnosti samotného trypsínu, EDTA sa pridáva na zvýšenie jeho aktivity. Trypsín je v prítomnosti séra inaktivovaný, preto je nevyhnutné odstrániť všetky stopy séra z kultivačného média premytím monovrstvy buniek pomocou PBS. 
5. Kultivačnú nádobu vrátime do inkubátora na 2-10 minút. Bunky by mali byť vystavené trypsín/EDTA tak dlho, aby sa odlepili. Dlhšia expozícia by mohla poškodiť receptory na povrchu buniek.
6. Skontrolujeme bunky pomocou inverzného mikroskopu, aby sme sa ubezpečili, že všetky bunky sa oddelili a plávajú. Bočné steny nádoby môžeme jemne poklepať, aby sme uvoľnili zostávajúce priľnuté bunky.
7. Resuspendujeme bunky v malom objeme čerstvého média, čím inaktivujeme trypsín. Odoberieme 100-200 μl a stanovíme počet buniek hemocytometrom. V prípade kultivácie buniek v médiu bez séra použijeme na inhibíciu trypsínu inhibítor trypsínu (pridáva sa v koncentrácií 1mg/ml). 
8. Požadovaný počet buniek prenesieme do novej označenej kultivačnej nádoby obsahujúcej zahriate médium. Ak je hustota zozbieraných buniek príliš nízka na ich presadenie s vhodnou hustotou do novej kultivačnej nádoby, môžeme centrifugovať bunky 5 minút pri 150 x g a resuspendovať do menšieho objemu média.
9. Inkubujeme podľa požiadaviek danej bunkovej línie.
10. Proces opakujeme podľa požiadaviek rastu bunkovej línie.