High resolution melting (HRM) - Manuály
Detekcia genotypov CDx-2 polymorfizmu v géne VDR
Anotácia: Cdx-2 polymorfizmus v géne pre receptor vitamínu D (VDR) sa u človeka študuje v súvislosti s vplyvom na vznik ochorenia osteoporózy. Uvedený polymorfizmus sa najčastejšie deteguje pomocou metódy PCR-RFLP. Detekcia polymorfizmu pomocou HRM metódy môže urýchliť analýzu (po PCR reakcii sa detekcia uskutoční behom niekoľkých minút), najmä v prípade, ak sa pri PCR-RFLP využívajú štandardné restrikčné endonukleázy, ktoré na priebeh reakcie vyžadujú niekoľko hodín.
Chemikálie: reakčný roztok pre HRM analýzu LightScanner
Master Mix (Idaho Technology, USA), primery CDx2_1, CDx2_2 (10 pmol/
μl), sterilná redestilovaná voda,
roztok ľudskej
genómovej DNA
Pomôcky: mikroskúmavky (0,2 ml a skúmavky kompatibilné k HRM
melteru), mikropipety,
termocykler, PCR sterilný box, HRM melter, rukavice
Postup:
1. Uskutočníme PCR reakciu na amplifikáciu úseku VDR génu s
CDx-2 polymorfizmom - reakcia bude prebiehať v celkovom
objeme 20 μl v termocykleri, pričom sa využijú primery CDx2_1,
CDx2_2;
Teplotný profil PCR je nasledovný:
- počiatočná 5 min.
denaturácia pri 94°C,
- 35x(denaturácia 40 s pri 94°C, annealing 40 s pri
61°C, polymerizácia 30 s pri 72°C),
- po poslednom cykle polymerizácia 7
min. pri 72°C;
Reakčná zmes PCR obsahuje 1x komerčný reakčný roztok pre
HRM analýzu LightScanner Master Mix (Idaho Technology, USA) s
optimalizovaným zložením tlmivého roztoku, MgCl2,
dNTP mixu, LCGreen® Plus farbičky a hot-start Taq DNA polymerázy. K
reakčnému roztoku pridáme primery vo výslednej koncentrácii
0,5
μmol/l a templátovú DNA (~ 50 ng).
2. Výsledný PCR produkt s veľkosťou 135
bp zahrejeme v termocykleri na 94°C počas 30 s. a schladíme na
30°C na 30
s.
3. Pripravené vzorky podrobíme HRM analýze na HRM melteri
4.
Vyhodnotíme jednotlivé krivky topenia (normalizácia,
diferenciácia, derivácia kriviek) pomocou softvéru k HRM melteru a na
základe ich analýzy stanovíme jednotlivé genotypy CDx-2 polymorfizmu.
