Sekvenovanie DNA prešlo od svojho vzniku v 70. rokoch minulého storočia dlhú cestu. Významným míľnikom bol projekt Human Genome Project, ktorý bol spustený v roku 1990 a dokončený v roku 2003. Projekt založený predovšetkým na metóde Sangerovho sekvenovania sa zameral na zmapovanie celého ľudského genómu a jeho úspech výrazne posunul naše chápanie biológie človeka a genetiky.Keď sa však zvýšil dopyt po rýchlejších, efektívnejších a nákladovo efektívnejších metódach sekvenovania, vyvinuli sa techniky sekvenovania novej generácie (NGS), ktoré prekonávajú Sangerove sekvenovanie. Tým sa za posledných niekoľko desaťročí znížili náklady na sekvenovanie celého ľudského genómu z 2,7 miliardy dolárov na iba niekoľko stoviek dolárov, čím sa personalizovaná medicína a genetické testovanie stali dostupnejšie širokej verejnosti. Gén je segment DNA zložený zo špecifickej sekvencie nukleotidových báz (adenínu, guanínu, cytozínu a tymínu). Pomocou sekvenova DNA dokážeme určiť primárnu štruktúru nukleových kyselín, to znamená určiť poradie nukleotidov v DNA reťazci (sekvenciu DNA). Znalosť sekvencie genómu je nevyhnutná pre ďalší výskum, pretože nám pomáha porozumieť molekulárnej podstate biologických procesov a je predpokladom pre rozvoj výskumov v rôznych odvetviach biológie. Metódy sekvenovania môžeme rozdeliť do troch skupín:
• Metódy prvej generácie (70.roky–2005)
• Metódy druhej generácie (2005–2010)
• Metódy tretej generácie (2010–súčasnosť)

METÓDY PRVEJ GENERÁCIE

Zatiaľ, čo techniky sekvenovania proteínov boli používané už v 50. rokoch minulého storočia, metódy na sekvenovanie DNA sa nepodarilo vyvinúť až do polovice 70. rokov dvadsiateho storočia. Vtedy boli takmer súčasne vyvinuté dve odlišné sekvenačné metódy, jedna skupinou Waltera Gilberta a druhá skupinou Frederika Sangera. Avšak tieto metódy boli časovo aj finančne veľmi náročné, používali rádioaktívne značené nukleotidy, čo značne znižovalo bezpečnosť práce. Postupne sa začala hlavne Sangerova metóda automatizovať a proces sekvenovania sa stal lacnejší, bezpečnejší a časovo dostupnejší. Sangerova metóda bola v roku 1990 použitá na projekt sekvenovania prvého ľudského genómu, ktorý bol úspešne ukončený v roku 2003. V dnešnej dobe už obe metódy prvej generácie nahradili výhodnejšie a lepšie metódy sekvenovania DNA.

MAXAM-GILBERTOVA METÓDA
Metóda bola vynájdená v roku 1977 na Harvardskej univerzite spoločnou prácou Waltera Gilberta a Allana Maxama. Gilbert v roku 1980 za tento objav získal Nobelovu cenu za chémiu. Je vhodná na štiepenie malých nukleotidových reťazcov dvojvláknovej i jednovláknovej DNA. Na vytvorenie rôzne dlhých fragmentov DNA využíva selektívnu chemickú degradáciu kópií DNA pomocou špecifických chemických látok. Postup v tejto metóde sa začína rozpletením dvojvlákna DNA na jednovláknovú DNA. Jeden 5’koniec fragmentu DNA vlákna rádioaktívne označíme a sekvenujeme pomocou kinázovej reakcie za použitia gamma -32P. Aby sme rozštiepili reťazec v špecifických polohách použijeme dimetylsulfát, ktorý selektuje puríny (A a G), hydrazín, ktorý selektuje pyrimidíny (C a T) a nakoniec piperidín. G sa môže rozštiepiť na A alebo príležitostne na G a C sa rozštiepi na C alebo príležitostne na T. Získali sme 4 skúmavky obsahujúce DNA fragmenty rôznych dĺžok, tie oddelíme v polyakrylamidovom géli pomocou elektroforézy. Následne gél umiestníme pod röntgenový film ukazujúci nám sériu tmavých pásov, ktoré zodpovedajú umiestneniu rádioaktívne označených molekúl DNA. Fragmenty sú usporiadané podľa veľkosti, sekvenciu DNA zistíme pri čítaní z dola nahor. Existuje viacero výhod chemickej metódy sekvenovania vrátane predĺženia životnosti, zníženia emisnej energie, zvýšenia autorádiografického rozlíšenia a zvýšenia stability produktov po označení. Avšak používanie rádioaktívneho značenia a nebezpečných chemikálií a technickú náročnosť, bola uvedená metodika postupne nahradená Sangerom.

SANGEROVA METÓDA
Medzi rizikové skupiny patria najmä mladí a starí jedinci. Dôležitú úlohu tu zohráva najmä stav enzymatických systémov (u juvenilných jedincov nie je úplne vyvinutý a u starých jedincov sú detoxikačné systémy menej aktívne), ako aj hmotnosť daného jedinca. U novorodencov a dojčiat sa uplatňujú aj ďalšie faktory, ako je neukončený vývin niektorých orgánov a orgánových systémov a neschopnosť aktívneho vylučovania niektorých látok obličkami. Vo všeobecnosti bývajú najodolnejšie adultné jedince, avšak mladé jedince so zrýchleným metabolizmom lepšie znášajú účinky napr. barbiturátov, resp. tália. Na druhej strane, morfium je lepšie tolerované starými jedincami. Je vhodná na štiepenie malých nukleotidových reťazcov dvojvláknovej i jednovláknovej DNA. Na vytvorenie rôzne dlhých fragmentov DNA využíva selektívnu chemickú degradáciu kópií DNA pomocou špecifických chemických látok. Používané chemikálie môžu štiepiť reťazec DNA len v mieste A, C, G a A alebo T a C. Reakcie prebiehajú samostatne v 4 rôznych skúmavkách, následne sú produkty týchto reakcií nanesené vedľa seba na polyakrylamidový gél s možnosťou vyhodnotenia výsledkov. Postup v tejto metóde sa začína rozpletením dvojvlákna DNA na jednovláknovú DNA. Jeden 5’koniec fragmentu DNA vlákna rádioaktívne označíme a sekvenujeme pomocou kinázovej reakcie za použitia gamma -32P. Aby sme rozštiepili reťazec v špecifických polohách použijeme dimetylsulfát, ktorý selektuje puríny (A a G), hydrazín, ktorý selektuje pyrimidíny (C a T) a nakoniec piperidín. G sa môže rozštiepiť na A alebo príležitostne na G a C sa rozštiepi na C alebo príležitostne na T. Získali sme 4 skúmavky obsahujúce DNA fragmenty rôznych dĺžok, tie oddelíme v polyakrylamidovom géli pomocou elektroforézy. Následne gél umiestníme pod röntgenový film ukazujúci nám sériu tmavých pásov, ktoré zodpovedajú umiestneniu rádioaktívne označených molekúl DNA. Fragmenty sú usporiadané podľa veľkosti, sekvenciu DNA zistíme pri čítaní z dola nahor (obr).

Sekvenovanie prvej generácie. (a) Metóda založená na chemickej degradácii pomocou Maxam-Gilbertovho sekvenovania. (b) Metóda ukončenia reťazca s použitím dideoxynukleotidov ako pri Sangerovom sekvenovaní. (Zdroj: Kang et al. 2019)

Využi pri ďalšom štúdiu tejto témy e-learningový kurz.

METÓDY DRUHEJ GENERÁCIE

Metódy druhej a tretej generácie sa nazývajú spoločným názvom ako Sekvenovanie novej generácie (NGS). Tento pojem označuje vysoko výkonné technológie sekvenovania, ktoré sú schopné sekvenovať množstvo rôznych sekvencií DNA v jednej reakcii. NGS sa líši od pôvodnej Sangerovej metódy hlavne svojou vysokou výkonnosťou zabezpečenou troma hlavnými vylepšeniami. Po prvé je to konvertácia genetického materiálu na NGS knižnicu, čo je súbor rôznych sekvencií resp. fragmentov DNA. Po druhé, na zistenie presnej sekvencie nie je potrebná elektroforéza, pretože súčasne, cyklicky a paralelne prebieha detekcia signálov miliónov chemických reakcií, ktoré sú následne transformované do sekvenčných dát. Po tretie, nie stovky ale tísíce až milióny sekvenčných reakcií prebiehajú simultánne, čím sa výrazne zvyšuje rýchlosť sekvenovania. Nevýhoda spôsobená kratšou dĺžkou sekvenovaných fragmentov sa kompenzuje mnohonásobným opakovaním analýzy tej istej cieľovej oblasti genómu
Sekvenovanie druhej generácie pozostáva z týchto krokov:
• Príprava DNA templátu, resp. NGS knižnice
• Amplifikácia DNA knižnice
• Sekvenovanie

Metódy sekvenovania druhej generácie spôsobili revolúciu v sekvenovaní DNA tým, že umožnili simultánne sekvenovanie tisícok až miliónov fragmentov DNA. Tieto metódy sa líšia od tradičného Sangerovho sekvenovania svojou schopnosťou vykonávať paralelné sekvenovanie. Objavilo sa niekoľko široko používaných sekvenčných platforiem druhej generácie, jednou z nich je sekvenačná metóda Roche 454, ktorá sa opiera o pyrosekvenovanie, kde sa sekvencia určuje detekciou uvoľňovania pyrofosfátu, keď sa do templátu DNA pridávajú nukleotidy. Ďalšou platformou je sekvenovanie Ion Torrent, ktoré zisťuje uvoľňovanie vodíkových iónov počas syntézy DNA na určenie sekvencie. Široko používaná sekvenčná platforma Illumina využíva metódu sekvenovania podľa syntézy založenú na reverzibilných farbiacich terminátoroch. Ďalšia pripravovaná technológia, sekvenovanie SOLiD (Sekvenovanie pomocou oligonukleotidovej ligácie a detekcie), využíva prístup založený na ligácii pomocou reverzibilných terminátorov na určenie sekvencie DNA. Tieto technológie sekvenovania druhej generácie výrazne zvýšili priepustnosť a rýchlosť sekvenovania DNA, čo umožnilo široké spektrum aplikácií vo výskume genomiky a klinickej diagnostike. Tieto platformy umožnili sekvenovanie celého genómu, analýzu transkriptómov a cielené sekvenovanie, čo viedlo k prelomom v oblasti genetických variácií, výskumu chorôb a personalizovanej medicíny.

METÓDY TRETEJ GENERÁCIE

Ďalšia éra technológie sekvenovania DNA, nazývaná sekvenovanie tretej generácie (TGS), získala miesto v biológii ako spôsob štúdia genómov, transkriptómov a metagenómov v bezprecedentnom rozlíšení. Tieto technológie fungujú na základe sekvenovania jednej molekuly a poskytujú:
•Dlhé čítanie bez zosilnenia.
•Priama detekcia epigenetických modifikácií na natívnej DNA.
•Priame sekvenovanie cez oblasti genómu neprístupné alebo ťažko analyzovateľné platformami na krátke čítanie.
•Jednotné pokrytie genómu, pretože nie sú také citlivé na obsah GC ako platformy na krátke čítanie.
V súčasnosti sú k dispozícii dve technológie TGS:
1) sekvenovanie jednej molekuly v reálnom čase (SMRT) na PacBio Sequel II.
2) sekvenovanie nanopórov na Oxford Nanopore Technologies (ONT) GridION X5.
Sequel II a GridION X5 majú rôznu priepustnosť, ale obe fungujú tak, že čítajú nukleotidové sekvencie na úrovni jednej molekuly a produkujú podstatne dlhšie čítania (10 kb-100 kb) ako súčasné metódy NGS. Nespracované čítania majú chybovosť vyššiu ako systémy Illumina; tieto chyby sú však náhodné, a tak algoritmy na opravu chýb môžu zlepšiť presnosť na nukleotid na > 99,99 % alebo viac s dostatočným pokrytím. Aj keď sú obe technológie sekvenovania s jednou molekulou, technológia za platformami PacBio a ONT sa značne líši.

Tieto platformy umožnili sekvenovanie celého genómu, analýzu transkriptómov a cielené sekvenovanie, čo viedlo k prelomom v oblasti genetických variácií, výskumu chorôb a personalizovanej medicíny. V priebehu rokov sa dosiahlo mnoho vývoja v druhej i tretej generácii sekvenčných metód a sú znázornené na obrázku a stručne opísané v tabuľke.

Rôzne generácie platforiem NGS (Zdroj: Satam H. et al.2023)

Prehľad rôznych NGS technológií (Zdroj: Satam H. et al. 2023)

Využi pri ďalšom štúdiu tejto témy e-learningový kurz.