Fragmentačná STR analýza - manuály

Identifikácia osôb prostredníctvom analýzy STR sekvencií

Anotácia: Na identifikáciu jedincov sa využívajú oblasti genómu, v ktorých sa jedinci medzi sebou odlišujú, najmä tzv. mikrosatelitné (STR) sekvencie. V rámci týchto sekvencií sa jedinci odlišujú počtom opakovaní základného motívu (sekvencie nukleotidov). V rámci experimentu budeme vo vzorke jedinca identifikovať 19 STR sekvencií, na základe ktorých určíme jeho unikátny profil v týchto STR sekvenciách a pohlavie podľa génu pre amelogenin. Jednotlivé STR zahŕňajú nasledovné lokusy: D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D1S1656, D2S441, D10S11248, D12S391, D22S1405, SE33. Na ich identifikáciu využijeme komerčne dostupnú súpravu (http://www.amplgen.com; http://www.pcrdiagnostics.eu), ktorá umožňuje detekciu uvedených STR pomocou fragmentačnej STR analýzy. Jednotlivé lokusy sa najskôr naamplifikujú s použitím PCR reakčnej zmesi s fluorescenčne značenými primermi a vzniknuté fragmenty sa separujú kapilárnou elektroforézou s presným určením ich dĺžky.

Chemikálie a materiál: Komerčná súprava - 12 stripov po 8 x 0.2 ml reakcií, aktivačný roztok, deionizovaná voda, alelový marker (Ladder), kontrolná DNA, veľkostný štandard; Hi-Di Formamid, 10 x tlmivý roztok pre genetický analyzátor, polymér (POP-4), vzorky DNA

Pomôcky a vybavenie: termocykler, genetický analyzátor (kapilárna elektroforéza) s príslušenstvom a kapilárou, pipety, mikroskúmavky, špičky, rukavice

Postup:
1. Z jednotlivých lyofilizovaných komponentov súpravy v skúmavkách pripravíme pracovné roztoky. K alelovému markeru pridáme 20 µl deionizovanej vody, premiešame a krátko scentrifugujeme. V prípade potreby uskladníme pri 4 °C. 1 µl markera sa pridáva počas elektroforézy do zmesi formamidu/veľkostného štandardu. Kontrolnú DNA zmiešame s 20 µl deionizovanej vody, premiešame a krátko scentrifugujeme. Do PCR reakcie sa pridáva 1 µl roztoku kontrolnej DNA, čo predstavuje 500 pg DNA. Veľkostný štandard obsahuje 24 fragmentov DNA s veľkosťami 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 230, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440 a 450 bp. Pracovný roztok pripravíme pridaním 120 µl deionizovanej vody, necháme 5 minút inkubovať pri izbovej teplote a premiešame. Roztok môžeme uskladniť pri 4°C – 8°C niekoľko týždňov. Počas analýzy na genetickom analyzátore pridáme 1 µl štandardu do každej skúmavky, obsahujúcej formamid a PCR produkty.
2. Pripravíme si reakčnú zmes pre PCR amplifikáciu. Reakcia bude prebiehať v celkovom objeme 25 µl. Reakčná zmes pozostáva s nasledovných komponentov:

reagent	objem na 1 vzorku
aktivačný roztok	5 µl
templátová DNA (0,2-2 ng)	10 µl
deionizovaná voda	10 µl

Po pridaní aktivačného roztoku do skúmavky zmes necháme postáť 2 min. Až potom pridáme roztok templátovej DNA. Reakčnú zmes premiešame. Do jednej skúmavky dáme 1 µl kontrolnej DNA (súčasť súpravy) a 19 µl vody, jedna skúmavka bude slúžiť ako negatívna kontrola bez DNA - pridáme do nej aktivačný roztok a 20 µl vody. Pri analýze viacerých vzoriek jednotlivé zložky (okrem templátovej DNA) zmiešame v potrebných množstvách, rozpipetujeme do skúmaviek a nakoniec do každej skúmavky pridáme príslušný objem roztoku templátovej DNA (jednotlivé vzorky).
3. Uskutočníme PCR amplifikáciu jednotlivých lokusov. Skúmavky umiestnime do termocyklera s nasledovným programom:
• denaturácia 3 min. pri 94 °C
• 4 x (denaturácia 30 s. pri 98 °C; annealing 2 min. pri 59 °C; polymerizácia 90 s. pri 72 °C)
• 6 x (denaturácia 30 s. pri 94 °C; annealing 2 min. pri 59 °C; polymerizácia 90 s. pri 72 °C)
• 20 x (denaturácia 30 s. pri 90 °C; annealing 2 min. pri 59 °C; polymerizácia 75 s. pri 72 °C)
• 1 x 5 min. pri 68 °C po rampingu z 59 °C do 68 °C 0,3°C/s
4. Elektroforézu naamplifikovaných PCR produktov uskutočníme na genetickom analyzátore. Pred začiatkom je potrebné sa uistiť, či softvér ku genetickému analyzátoru je nakalibrovaný k použitiu danej komerčnej súpravy (obsahuje nainštalovaný tzv. matrix pre fluorescenčné farbičky, obsiahnuté v rámci použitej komerčnej súpravy). 
5. Pripravíme si zmes Hi-Di formamidu a veľkostného štandardu v pomere 10:1 a rozpipetujeme ju do každej skúmavky po 10 µl. K zmesi v jednotlivých skúmavkách postupne pridávame po 1 µl PCR produktu každej vzorky. Do jednej skúmavky dáme namiesto PCR produktu 1 µl alelového markera.
Poznámka: pri použití niektorých súprav je po tomto kroku potrebná teplotná denaturácia zmesi v skúmavkách.
6. Skúmavky umiestnime do genetického analyzátora podľa inštrukcií výrobcu prístroja. Dbáme na to, aby sme pri nastavení behu elektroforézy použili správny matrix, modul behu elektroforézy a protokol.
7. Výsledky elektroforézy vyhodnotíme s použitím príslušného softvéru. Jednotlivé píky na elektroforeograme priradíme k analyzovaným lokusom na základe manuálu ku komerčnej súprave a stanovíme genotyp v každom lokuse a pohlavie jedinca.