Sekvenovanie novej generácie - manuály

Detekcia mutácií súvisiacich so vznikom cystickej fibrózy u človeka pomocou technológie sekvenovania novej generácie

Anotácia: Cystická fibróza je monogénové ochorenie s autozómovo recesívnym typom dedičnosti, zapríčinené mutáciami v géne CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). V kaukazskej populácii sa s týmto ochorením rodí jedno dieťa z 2000-3000. Doposiaľ bolo v géne CFTR identifikovaných viac ako 1900 mutácií, avšak len relatívne malý súbor mutácií je príčinou ochorenia. V súčasnosti je k dispozícii viacero metód pre identifikáciu zodpovedných mutácií, počet analyzovaných mutácií je tiež rôzny. Napríklad American College of Medical Genetics (ACMG) odporúča testovať 23 najdôležitejších mutácií. V našom experimente na detekciu mutácií využijeme metódu sekvenovania novej generácie, technológiu firmy Illumina (http://www.illumina.com) a súpravu chemikálií pre detekciu CFTR mutácií, ktorá umožňuje identifikáciu 139 mutácií v géne CFTR. Miesta jednotlivých mutácií sú ohraničené oligonukleotidovými sondami, pričom sekvencia medzi nimi sa komplementárne dosyntetizuje a spojí tak obidve sondy do jednej sekvencie. Takto vznikne súbor fragmentov DNA, ktoré sa následne amplifikujú a sekvenujú (pozri obrázok). Mutantné varianty sa porovnávajú s kontrolnou sekvenciou.

Chemikálie a materiál: komerčná súprava pre detekciu mutácií v CFTR géne kompatibilná pre aplikáciu na genetickom analyzátore (http://www.illumina.com), obsahujúca sekvenačný oligo mix, hybridizačný roztok, extenzno-ligačný mix, mix primerov C,D,E, mix primerov 1,2,10, DNA-polymerázu, PCR reakčný roztok, normalizačný roztok, PhiX internú kontrolu, sekvenačná kazeta, premývacie roztoky, PCR čistiaci roztok s magnetickými časticami, roztok pre knižnice s magnetickými časticami, premývací roztok pre knižnice, skladovací roztok pre knižnice, zrieďovací roztok pre knižnice, prietoková komôrka "Flow Cell", premývací tlmivý roztok PR2, platničky - hybridizačnú, filtračnú, amplifikačnú, čistiacu, normalizačnú, združenú platničku, elučný roztok; 10 N NaOH, TE roztok (Tris, EDTA), RNase/DNase-free voda, etanol.

Pomôcky a vybavenie: genetický analyzátor pre sekvenovanie novej generácie, platforma Illumina, termoblok, inkubátor, centrifúga, termocykler, trepačka pre platničky, magnetický stojan pre platničky, pipety, 96-jamkové platničky (0,2 μl) s krycou fóliou, nádoby na premývanie, špičky, kónické skúmavky 15 ml, mikroskúmavky 1,5 ml.

Postup:
1. Na analýzu potrebujeme vzorky genómovej DNA, vyizolovanej z krvi.
2. Na ovládacom paneli genetického analyzátora vytvoríme pracovný list vzoriek (sample sheet), kde zadáme základné parametre o vzorkách (pacientoch, sample ID), barcode ID z komerčnej súpravy (sekvenačnej kazety), použitie typov primerov. Grafický výstup vytlačíme - bude slúžiť ako vzor pri pipetovaní vzoriek do platničky.
3. Uskutočníme hybridizáciu oligonukleotidov. Podľa grafického výstupu z bodu 2 označíme príslušné jamky na hybridizačnej platničke a do jamiek pridáme 5 μl každej vzorky a kontroly (50 ng/μl), ďalej pridáme 5 μl sekvenačného oligo mixu, 40 μl hybridizačného roztoku. Jemne premiešame, platničku prikryjeme krycou fóliou, centrifugujeme 1 min. pri 1000 x g a inkubujeme 1 min. pri 95 °C. Následne znížime teplotu termobloku na 40 °C a necháme vzorky inkubovať, kým teplota na 40 °C neklesne (asi 80 min.).
4. Podľa grafického výstupu z bodu 2 označíme príslušné jamky na filtračnej platničke, jamky premyjeme premývacím roztokom (45 μl) a prikryté vrchnákom centrifugujeme 5 min. pri 2400 x g. Hybridizačnú platničku so vzorkami (bod 3) centrifugujeme 1 min. pri 1000 x g a obsah jamiek z nej prenesieme do príslušných jamiek na premytej filtračnej platničke. Premyjeme 45 μl premývacieho roztoku a centrifugujeme 5 min. pri 2400 x g. Premývanie zopakujeme.
5. K vzorkám, zachyteným na filtračnej platničke pridáme 45 μl extenzno-ligačného mixu. Platničku prikryjeme a inkubujeme 45 min. pri 37 °C. Týmto krokom sa sekvencia medzi sondami komplementárne dosyntetizuje a spojí tak obidve sondy do jednej sekvencie. Platničku centrifugujeme 2 min. pri 2400 x g a do každej jamky pridáme 25 μl čerstvo pripraveného 0,05 N NaOH. Platničku prikryjeme a inkubujeme 5 min. pri izbovej teplote.
6. V mikroskúmavke zmiešame 5,6 μl DNA-polymerázy s 280 μl PCR reakčného roztoku a premiešame. Podľa grafického výstupu z bodu 2 označíme príslušné jamky na amplifikačnej platničke. Do jamiek pridáme 4 μl mixu primerov C,D alebo E, 4 μl mixu primerov 1,2 alebo 10 (kombinujeme podľa manuálu) a 22 μl zmesi DNA-polymerázy a PCR reakčného roztoku. Následne starostlivo do každej jamky prepipetujeme 20 μl roztoku so vzorkami z filtračnej platničky z bodu 5. Amplifikačnú platničku zakryjeme fóliou, centrifugujeme 1 min. pri 1000 x g a vložíme do termocyklera s nasledovným teplotným profilom:
• 3 min. pri 95°C
• 25 x 30 s. pri 95°C, 30 s. pri 62°C, 60 s. pri 72°C)
• 5 min. pri 72°C
V tomto kroku sa fragmenty DNA obsahujúce miesta mutácií amplifikujú, pričom sa na ich konce dosyntetizujú sekvencie, umožňujúce rozpoznanie konkrétnej mutácie (tzv. indexy) a tiež adaptéry, umožňujúce tvorbu klastrov v rámci NGS sekvenovania "mostíkovou" PCR.
7. Podľa grafického výstupu z bodu 2 označíme príslušné jamky na čistiacej platničke a do každej jamky napipetujeme 45 μl PCR čistiaceho roztoku s magnetickými časticami. Amplifikačnú platničku centrifugujeme 1 min. pri 1000 x g a starostlivo do každej jamky prepipetujeme celý objem roztoku so vzorkami z amplifikačnej do čistiacej platničky. Premiešame a inkubujeme 10 min. pri izbovej teplote. Platničku umiestnime na magnetický stojan a po 2 min. opatrne z každej jamky odpipetujeme všetok supernatant. Jamky následne 2x premyjeme 200 μl 80 % etanolu. Týmto krokom prečistíme PCR produkty od ostatných komponentov reakcie. Platničku vyberieme z magnetického stojana a necháme vysušiť 10 min. Do každej jamky následne napipetujeme 30 μl elučného roztoku. Premiešame a inkubujeme 2 min. pri izbovej teplote.
8. V mikroskúmavke zmiešame 72 μl roztoku pre knižnice s magnetickými časticami s 394 μl normalizačného roztoku a premiešame. Podľa grafického výstupu z bodu 2 označíme príslušné jamky na normalizačnej platničke. Čistiacu platničku umiestnime na magnetický stojan a po 2 min. opatrne z každej jamky odpipetujeme 20 μl supernatantu do príslušnej jamky na normalizačnej platničke. Do každej jamky tiež pridáme 45 μl zmesi roztoku pre knižnice s magnetickými časticami a normalizačného roztoku. Platničku premiešavame na trepačke 30 min. Následne normalizačnú platničku umiestnime na magnetický stojan a po 2 min. z každej jamky odstránime všetok supernatant. Normalizačnú platničku vyberieme z magnetického stojana a jamky premyjeme premývacím roztokom pre knižnice nasledovne: do každej jamky dáme 45 μl prmývacieho roztoku, platničku premiešavame na trepačke 5 min., platničku umiestnime na magnetický stojan a po 2 min. z každej jamky odstránime všetok supernatant. Premývanie zopakujeme. Po dôkladnom odstránení zvyškov premývacieho roztoku do každej jamky pridáme 30 μl 0,1 N NaOH a platničku premiešavame na trepačke 5 min. V tomto kroku sa uskutočňuje tzv. normalizácia knižníc, aby každá z knižníc mala rovnaké zastúpenie vo výslednej združenej vzorke, ktorá sa bude sekvenovať. 
9. Podľa grafického výstupu z bodu 2 označíme príslušné jamky na združenej platničke. Do každej jamky pridáme 30 μl skladovacieho roztoku pre knižnice. Po premiešaní normalizačnú platničku umiestnime na magnetický stojan a po 2 min. z každej jamky odpipetujeme všetok supernatant do príslušnej jamky na združenej platničke. Platničku prikryjeme fóliou a centrifugujeme 1 min. pri 1000 x g.
10. Pripravíme knižnicu PhiX internej kontroly. Najskôr zmiešame 2 μl knižnice 10nM PhiX internej kontroly s 8 μl TE roztoku (1x) a výsledný roztok zmiešame s 10 μl 0,1 N NaOH. Krátko premiešame, centrifugujeme 1 min. pri 280 x g a inkubujeme 4,5 min. pri izbovej teplote. 2 μl takto pripraveného roztoku napokon zmiešame s 98 μl zrieďovacieho roztoku pre knižnice, čím získame 20 pM roztok. Ďalej  pripravíme sekvenačnú kazetu tak, že ju rozmrazíme v deionizovanej vode ponorením po vyznačenú rysku. Asi po 1 hod. kazetu osušíme a vizuálne skontrolujeme tekutý stav reagentov v jednotlivých pozíciách.
11. Do 1,5 ml mikroskúmavky (ZK) prenesieme po 5 μl roztoku z každej knižnice zo združenej platničky a premiešame. Do inej 1,5 ml mikroskúmavky (PX) dáme 585 μl zrieďovacieho roztoku pre knižnice a pridáme 6 μl PhiX internej kontroly (20 pM), premiešame. Následne prenesieme 9 μl zmesi knižníc zo skúmavky ZK do skúmavky PX, premiešame, centrifugujeme 1 min. pri 1000 x g a inkubujeme 2 min. pri 96 °C. Skúmavku následne ponoríme do kúpeľa s ľadovou vodou a inkubujeme 5 min.  
12. Výslednú zmes z mikroskúmavky z predchádzajúceho bodu napipetujeme do príslušnej pozície (Load Samples) v pripravenej sekvenačnej kazete. V softwarovom rozhraní genetického analyzátora nastavíme sekvenačný beh (Sequence). Premyjeme a dôkladne osušíme prietokovú komôrku a vložíme ju do prístroja. Do prístroja na príslušné miesto tiež vložíme nádobu s premývacím tlmivým roztokom PR2 a odpadovú nádobu. Následne do prístroja vložíme sekvenačnú kazetu. Skontrolujeme parametre a výsledky kontroly pred vlastným behom.
13. Spustíme sekvenačný beh (Start Run). Priebeh behu môžeme sledovať cez rozhranie MCS alebo pomocou ďalšieho počítača cez Sequencing Analysis Viewer (SAV). Sekvenačné dáta môžeme analyzovať na počítači pomocou funkcie Reporter alebo na „cloud-e“ pomocou tzv. BaseSpace. Obidva systémy poskytujú informácie o priradení, variantoch a priradení contigov ku každému genómu a pre každú vzorku.