Izolácia DNA - Manuály

Izolácia genómovej DNA z krvi

Na izoláciu DNA použijeme krv odobratú do antikoagulačného roztoku (zabraňuje zrážaniu), napr. citrát sodný, EDTA, heparín,

Chemikálie: roztok TE (10 mmol/l Tris-HCl pH=8,1, 1 mmol/l EDTA), lyzačný roztok (100 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl pH=7,5, 1 % SDS), proteináza K (20 mg/ml), nasýtený roztok NaCl, 96 % etanol, 70 % etanol, redestilovaná voda

Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, termoblok, centrifúga

Postup:
1. k 300 μl krvi pridáme 1 ml roztoku TE a centrifugujeme 5 min. pri 12 000 ot/min
2. odstránime supernatant (pipetou) a k peletu pridáme 1 ml roztoku TE, centrifugujeme 5 min. pri 12 000 ot/min
3. opakujeme krok 2
4. k usadenine leukocytov pridáme 300 μl lyzačného roztoku a 3 μl proteinázy K (20 mg/ml), obsah skúmavky pretrepeme
5. vzorky inkubujeme 1 hod. pri 55 °C
6. k lyzátu pridáme 600 μl nasýt. NaCl, pretrepeme a centrifugujeme centrifugujeme 5 min. pri 12 000 ot/min
7. 300 μl roztoku (bez zrazeniny) opatrne prenesieme do čistej skúmavky, pridáme 600 μl vychladeného 96 % etanolu, opatrne premiešame otočením skúmavky; DNA sa vyzráža vo forme chumáčovitej zrazeniny; zrazeninu necháme priľnúť na stenu skúmavky a supernatant odstránime
8. k zrazenine pridáme 500 μl 70 % etanolu premiešame, zrazeninu opäť necháme priľnúť na stenu skúmavky a supernatant odstránime
9. zrazeninu necháme vysušiť 10 min. pri 37 °C
10. zrazeninu rozpustíme v 50 μl vody alebo TE roztoku počas 2 hod. pri 37 °C 

Izolácia genómovej DNA z pečene

Chemikálie: lyzačný roztok (50 mmol.l -1 Tris – HCl, pH = 8.0, 100 mmol.l -1 EDTA, pH = 8.0, 100 mmol.l -1 NaCl, 1 % SDS, 0.2 mg/ml proteinaza K), roztok NaCl (4 mol.l -1), TE roztok (10 mmol.l -1 Tris – HCl, pH = 8.0, 1 mmol.l -1 EDTA, pH = 8.0), izopropanol, 96 % etanol, 70 % etanol

Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, termoblok, centrifúga, trepačka, 100 -200 mg čerstvej alebo zmrazenej pečene z králika

Postup:
1. do 0.5 ml lyzačného roztoku v 1.5 ml skúmavke vložíme pinzetou asi 100 mg králičej pečene a nožnicami ho rozstriháme na čo najmenšie kúsky; zmes inkubujeme pri teplote 50°C počas 2-3 hodín za stáleho miešania (alebo cez noc bez miešania)
2. pridáme 280 μl 4 mol.l -1 NaCl a miešame 10 min. na trepačke
3. centrifugujeme v centrifúge pri 13 000 rpm, 15 min., pri laboratórnej teplote
4. supernatant prenesieme do čistej mikroskúmavky, pridáme 0,5 ml izopropanolu a premiešame, pokiaľ sa nevytvorí viditeľná zrazenina DNA
5. zrazeninu špičkou pipety prenesieme do čistej skúmavky s 1 ml 96 % etanolu, necháme premývať 5 min. pri laboratórnej teplote.
6. prepláchnutú zrazeninu DNA prenesieme opäť špičkou pipety do čistej skúmavky s 1 ml 70 % etanolu
7. po 5 minútach etanol odstránime pipetou, DNA vysušíme pri laboratórnej teplote a rozpustíme v 100-200 μl sterilného roztoku TE
8. DNA rozpustenú v TE roztoku môžeme krátkodobo skladovať pri teplote 4°C alebo pre dlhšie uskladnenie zmraziť pri – 20°C